蛋白質(zhì)是構(gòu)成生物體細(xì)胞組織的重要成分。食物中的蛋白質(zhì)是人體中氮的惟一來(lái)源, 具有糖類和脂肪不可替代的作用。蛋白質(zhì)與營(yíng)養(yǎng)代謝、細(xì)胞結(jié)構(gòu)、酶、激素、病毒、免疫、物質(zhì)運(yùn)轉(zhuǎn)和遺傳等密切相關(guān), 其分離與定性、定量分析是生物化學(xué)和其他生物學(xué)科、食品檢驗(yàn)、臨床檢驗(yàn)、診斷疾病、生物藥物分離提純和質(zhì)量檢驗(yàn)中最重要的工作。隨著分析手段的不斷進(jìn)步, 對(duì)食品中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定方法也正向準(zhǔn)確和快速的方向發(fā)展。

目前, 測(cè)定食品中蛋白質(zhì)含量的方法有多種, 一般可分為間接方法和直接方法。間接方法是通過(guò)測(cè)定樣品中蛋白質(zhì)的含氮量進(jìn)行推算蛋白質(zhì)含量的方法; 直接方法則是根據(jù)蛋白質(zhì)的物理和化學(xué)性質(zhì), 直接測(cè)定蛋白質(zhì)含量的方法。多年來(lái), 利用蛋白質(zhì)的主要性質(zhì)( 如含氮量、肽鍵、折射率等) 和蛋白質(zhì)含有的特定氨基酸殘基( 如芳香基、酸性基、堿性基等) 來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)含量的方法不斷發(fā)展, 主要有凱氏定氮法( 國(guó)際經(jīng)典測(cè)定方法) 、分光光度法和滴定法等。所用到的儀器有凱氏定氮儀，也叫做蛋白質(zhì)測(cè)定儀。

1.1 凱氏定氮法

測(cè)定蛋白質(zhì)最常用的方法是凱氏定氮法, 它是測(cè)定試樣中總有機(jī)氮最準(zhǔn)確和最簡(jiǎn)單的方法之一, 是被國(guó)內(nèi)外作為法定的標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法。凱氏定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)分為樣品消化、蒸餾、吸收和滴定過(guò)程。在催化劑作用下, 試樣用濃硫酸消煮破壞有機(jī)物, 使其中的蛋白質(zhì)氮及其他有機(jī)氮轉(zhuǎn)化為氨態(tài)氮, 然后與硫酸結(jié)合生成硫酸銨, 加入強(qiáng)堿進(jìn)行蒸餾使氨逸出, 用硼酸吸收后, 再用酸滴定, 測(cè)出含氮量, 將結(jié)果乘以換算系數(shù), 計(jì)算出粗蛋白質(zhì)含量。然而該方法存在消化時(shí)間太長(zhǎng), 會(huì)產(chǎn)生有毒有害氣體, 因此必須在通風(fēng)櫥中進(jìn)行的弊端。宗留香等人對(duì)這一傳統(tǒng)方法進(jìn)行了改進(jìn), 即用Se 粉作催化劑進(jìn)行消化, 不用通風(fēng)櫥, 即實(shí)現(xiàn)了環(huán)保消化, 并提高了消化效率。

1.2 光度法

光度法分為考馬斯亮藍(lán)G- 250 法、雙縮脲法、Folin 酚法( Lowry 法) 、BCA 法和紫外吸收法。

1.2.1 考馬斯亮藍(lán)G- 250 法

考馬斯亮藍(lán)G- 250 與蛋白質(zhì)結(jié)合反應(yīng)十分迅速而且穩(wěn)定, 反應(yīng)2 min 左右即達(dá)到平衡, 其結(jié)合物可在室溫下1 h 內(nèi)保持穩(wěn)定。考馬斯亮藍(lán)G- 250 法是目前靈敏度最高的蛋白質(zhì)測(cè)定方法, 其最低蛋白質(zhì)檢測(cè)量可達(dá)1 μg, 比Folin 酚法的的靈敏度高約4 倍,這是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)與染料結(jié)合后產(chǎn)生的顏色變化很大,蛋白質(zhì)—染料復(fù)合物有更高的消光系數(shù), 因而光吸收隨蛋白質(zhì)濃度的變化比Lowry 法要大得多。該法方法簡(jiǎn)便, 易于操作, 所用試劑較少, 顯色劑易于配制; 干擾物質(zhì)少, 如糖、緩沖液還原劑和絡(luò)合劑等均不影響顯色。

1.2.2 雙縮脲法

雙縮脲法對(duì)白蛋白、紅蛋白產(chǎn)生的顏色反應(yīng)相近, 不受溫度影響, 可快速測(cè)定蛋白質(zhì)含量, 但靈敏度低, 測(cè)定范圍為1~20 mg 蛋白質(zhì), 適用于精度要求不高的蛋白質(zhì)含量的測(cè)定, 常用于谷物蛋白質(zhì)含量測(cè)定。三羥甲基氨基甲烷和一些氨基酸、EDTA 等會(huì)干擾該反應(yīng)。李寧對(duì)凱氏定氮法、考馬斯亮藍(lán)法和雙縮脲法進(jìn)行了比較, 得出結(jié)論為, 凱氏定氮法、雙縮脲法和考馬斯亮藍(lán)染色法都可以測(cè)出被測(cè)的全部5 種樣品的蛋白質(zhì)含量, 其中凱氏定氮法是目前分析有機(jī)化合物含氮量常用的方法, 是一種蛋白質(zhì)測(cè)定的經(jīng)典方法,適用樣品廣泛和用于結(jié)果要求準(zhǔn)確的測(cè)試; 雙縮脲法和考馬斯亮藍(lán)染色法的測(cè)試過(guò)程簡(jiǎn)便、迅速, 用于可以準(zhǔn)確配取標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液而準(zhǔn)確性要求不高的測(cè)試中。可以根據(jù)含氮量的不同選擇以上兩種方法。

1.2.3 Folin 酚法

Folin 酚法是雙縮脲法的發(fā)展, 它結(jié)合了雙縮脲試劑和酚試劑與蛋白質(zhì)的反應(yīng)。Folin 酚法廣泛應(yīng)用于水溶性蛋白質(zhì)含量的測(cè)定。Folin 酚法的靈敏度比雙縮脲法高100 倍, 肽鍵顯色效果增強(qiáng), 減少了因蛋白質(zhì)種類引起的偏差。該法由于兩步呈色反應(yīng)可以疊加, 其靈敏度特別高, 所以適用于20~250 μg 微量蛋白質(zhì)的測(cè)定, 可檢測(cè)的最低蛋白質(zhì)量為5 μg。

1.2.4 BCA 法

BCA 蛋白質(zhì)檢測(cè)試劑是當(dāng)前比Lowry 法更優(yōu)越的專用于檢測(cè)總蛋白質(zhì)含量的產(chǎn)品, 該法快速靈敏、穩(wěn)定、可靠, 且對(duì)不同種類蛋白質(zhì)的變異系數(shù)甚小, 可檢測(cè)到的蛋白質(zhì)量為0.5 μg, 是目前已知的最靈敏的蛋白質(zhì)檢測(cè)試劑之一。

1.2.5 紫外吸收法

紫外吸收法簡(jiǎn)便、靈敏、快速, 不消耗樣品, 低濃度鹽類不干擾其測(cè)定。該法的缺點(diǎn)是測(cè)定與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸含量差異較大的蛋白質(zhì)時(shí), 有一定的誤差。紫外吸收法適用于測(cè)試無(wú)色樣品, 對(duì)于有色樣品, 需進(jìn)行預(yù)處理, 排除顏色干擾后才適用于此方法。另外核酸在紫外區(qū)也有強(qiáng)吸收, 但通過(guò)校正可以消除。

在蛋白質(zhì)測(cè)定中, 光度法應(yīng)用最多, 適用較廣,對(duì)該類方法的研究較深入并不斷被發(fā)展。有機(jī)染料結(jié)合分光光度法測(cè)定蛋白質(zhì), 操作簡(jiǎn)便, 比較靈敏, 一般實(shí)驗(yàn)室條件均能滿足檢測(cè)要求,近年來(lái)國(guó)內(nèi)外對(duì)該類方法的研究應(yīng)用備加重視。該類方法的基本原理是在酸性介質(zhì)中, 蛋白質(zhì)的肽鍵和N端氨基質(zhì)子化成陽(yáng)離子, 由于電荷作用, 蛋白質(zhì)與陰離子染料結(jié)合沉淀或改變結(jié)合染料的光吸收特性, 由染料顏色的減退或變化的程度來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)的含量。考馬斯亮藍(lán)G- 250 染料已被廣泛應(yīng)用; 橙紅G、溴甲酚綠、埃鉻青R、溴酚藍(lán)、酸性品紅等染料也已被用于蛋白質(zhì)測(cè)定; 偶氮胂K、偶氮胂Ⅲ、偶氮胂M、硝基磺酚C、硝基磺酚S、氯磺酚K、氯磺酚S、茜紅素S、變色酸2C、變色酸2B、曙紅Y等染料測(cè)定蛋白質(zhì)的分光光度法研究均有報(bào)道。

近幾年利用金屬離子和有機(jī)染料形成配合物體系, 結(jié)合光度法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的方法得到了發(fā)展。金屬離子與含有- OH 或C=O 的有機(jī)染料相遇時(shí), 氧原子中的孤對(duì)電子可順利進(jìn)入雜化軌道, 形成穩(wěn)定的配合體系, 在酸性條件下, 該體系遇到結(jié)構(gòu)不對(duì)稱的蛋白質(zhì)分子時(shí), 互相極化產(chǎn)生靜電作用而組合成新的大分子團(tuán), 改變了原體系的廣譜性能, 從而能定量測(cè)定蛋白質(zhì)的含量。此類方法具有靈敏度高, 線性范圍廣, 干擾離子少, 操作簡(jiǎn)單、快速及適于常規(guī)應(yīng)用等特點(diǎn)。金屬離子—有機(jī)染料結(jié)合分光光度法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的發(fā)展很快, 如Cu ( II- 氯磺酚S 配合物、Cu ( II) —偶氮胂K 等。熒光光度法用于蛋白質(zhì)定量測(cè)定是近年逐漸興起的新方法, 利用反應(yīng)物的熒光強(qiáng)度隨蛋白濃度的增加而增加的現(xiàn)象進(jìn)行蛋白質(zhì)測(cè)定, 并具有工作曲線的線性范圍窄和檢出限高的特點(diǎn)。用于熒光光度法的試劑有吖啶橙、茜紅素S、曙紅Y 和燦爛甲酚藍(lán)等。

1.3 滴定法

1.3.1 甲醛滴定法( 指示劑滴定法)

該法節(jié)省試劑, 分析速度快, 操作簡(jiǎn)便易行。劉玉蘭等人分別用甲醛滴定法和凱氏定氮法測(cè)定棉籽餅、大豆、花生、小麥、玉米和蠶豆等蛋白質(zhì)含量,結(jié)果基本一致, 偏差小于0.20。

1.3.2 pH 滴定法

pH 滴定法是指酸堿滴定至某一指定pH 值時(shí),根據(jù)滴定劑用量和有關(guān)公式計(jì)算被測(cè)物濃度或含量的方法。它是在水溶液中直接滴定極弱酸堿的最新方法。該方法必須確定合適的pH 值。張大倫等人以玻璃電極為指示電極, 飽和甘汞電極為參比電極, 測(cè)定了大豆和花生的蛋白質(zhì)含量, 結(jié)果與傳統(tǒng)凱氏定氮法的測(cè)定結(jié)果相一致。

1.3.3 甲醛改進(jìn)滴定法

馬美范和黃曉東將甲醛滴定法和pH 滴定法相結(jié)合, 根據(jù)甲醛法的原理, 以pH 計(jì)替代指示劑指示滴定終點(diǎn)。當(dāng)銨離子與甲醛迅速反應(yīng)時(shí)放出同物質(zhì)量的酸, 生成的酸用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定, 用電位滴定計(jì)指示化學(xué)計(jì)量點(diǎn), 根據(jù)消耗的氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液用量計(jì)算出蛋白質(zhì)含量。運(yùn)用該法測(cè)定蛋白質(zhì)時(shí),待測(cè)液必須是中性, 中和時(shí)必須嚴(yán)格控制溶液的pH 值, 以免銨鹽分解引起誤差。HCHO 可被空氣氧化為甲酸, 宜臨用前配制。該法所獲結(jié)果與凱氏定氮法無(wú)顯著差異。

2 結(jié)束語(yǔ)

以上幾種蛋白質(zhì)常用的測(cè)定方法中, 最經(jīng)典的是凱氏定氮法, 但是這種方法需要自動(dòng)或半自動(dòng)的凱氏定氮儀, 這些儀器價(jià)格比較昂貴, 且需要專門的試劑, 因此較難普及。現(xiàn)在已有一些學(xué)者對(duì)其進(jìn)行改進(jìn)研究。在科研檢測(cè)工作中, 用戶可根據(jù)具體情況選用適宜的、較常用的這些測(cè)定蛋白的方法。