凱氏定氮法（英語：Kjeldahl method，全稱凱耶達(dá)爾定氮法，簡稱凱氮法）是分析化學(xué)中一種常用的確定有機(jī)化合物中氮含量的檢測方法。這種方法是由凱耶達(dá)爾于在1883年發(fā)明。凱氏定氮法是分析有機(jī)化合物含氮量的常用方法。要測定有機(jī)物含氮量，通常是設(shè)法使其轉(zhuǎn)變成無機(jī)氮，再進(jìn)行測定。

一、原理：
凱氏定氮法首先將含氮有機(jī)物與濃硫酸共熱，經(jīng)一系列的分解、碳化和氧化還原反應(yīng)等復(fù)雜過程，最后有機(jī)氮轉(zhuǎn)變?yōu)闊o機(jī)氮硫酸銨，這一過程稱為有機(jī)物的消化。為了加速和完全有機(jī)物質(zhì)的分解，縮短消化時(shí)間，在消化時(shí)通常加入硫酸鉀、硫酸銅、氧化汞、過氧化氫等試劑，加入硫酸鉀可以提高消化液的沸點(diǎn)而加快有機(jī)物分解，除硫酸鉀外，也可以加入硫酸鈉、氯化鉀等鹽類類提高沸點(diǎn)，但效果不如硫酸鉀。硫酸銅起催化劑的作用。凱氏定氮法中可用的催化劑種類很多，除硫酸銅外，還有氧化汞、汞、硒粉、鉬酸鈉等，但考慮到效果、價(jià)格及環(huán)境污染等多種因素，應(yīng)用最廣泛的是硫酸銅。使用時(shí)常加入少量過氧化氫、次氯酸鉀等作為氧化劑以加速有機(jī)物氧化。消化完成后，將消化液轉(zhuǎn)入凱氏定氮儀反應(yīng)室，加入過量的濃氫氧化鈉，將NH4+轉(zhuǎn)變成NH3，通過蒸餾把NH3驅(qū)入過量的硼酸溶液接受瓶內(nèi)，硼酸接受氨后，形成四硼酸銨，然后用標(biāo)準(zhǔn)鹽酸滴定，直到硼酸溶液恢復(fù)原來的氫離子濃度。滴定消耗的標(biāo)準(zhǔn)鹽酸摩爾數(shù)即為NH3的摩爾數(shù)，通過計(jì)算即可得出總氮量。在滴定過程中，滴定終點(diǎn)采用甲基紅-次甲基藍(lán)混合指示劑顏色變化來判定。測定出的含氮量是樣品的總氮量，其中包括有機(jī)氮和無機(jī)氮。
以蛋白質(zhì)為例，反應(yīng)式如下：

消化：蛋白質(zhì) + H2SO4→（NH4）2SO4
+ SO2↑+ CO2 ↑+ H2O
蒸餾：（NH4）2SO4 + 2NaOH→ Na2SO4
+ 2 H2O + 2NH3 ↑

2NH3 + 4H3BO3→（NH4）2B4O7
+ 5H2O

滴定：（NH4）2B4O7
+ 2HCl + 5H2O→2NH4Cl + 4 H3BO3

蛋白質(zhì)是一類復(fù)雜的含氮化合物，每種蛋白質(zhì)都有其恒定的含氮量[約在14％~18％，平均為16％（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）]。凱氏定氮法測定出的含氮量，再乘以系數(shù)6.25，即為蛋白質(zhì)含量。

本法適用于測定0.2～1.0mg氮的樣品測定。
通過本實(shí)驗(yàn)使學(xué)生能理解凱氏定氮法的原理，掌握凱氏定氮法的操作方法。

二、方法與步驟
將有機(jī)化合物與硫酸共熱使其中的氮轉(zhuǎn)化為硫酸銨。在這一步中，經(jīng)常會(huì)向混合物中加入硫酸鉀來提高中間產(chǎn)物的沸點(diǎn)（從169℃到189℃）。樣本的分解過程的終點(diǎn)很好判斷，因?yàn)檫@時(shí)混合物會(huì)變得無色且透明（開始時(shí)很暗）。

在得到的溶液中加入少量氫氧化鈉，然后蒸餾。這一步會(huì)將銨鹽轉(zhuǎn)化成氨。而總氨量（由樣本的含氮量直接決定）會(huì)由反滴定法確定：冷凝管的末端會(huì)浸在硼酸溶液中。氨會(huì)和酸反應(yīng)，而過量的酸則會(huì)在甲基橙的指示下用碳酸鈉滴定。滴定所得的結(jié)果乘以特定的轉(zhuǎn)換因子就可以得到結(jié)果。

通過凱氏定氮法測得的含氮量一般被稱作總凱氮量頁面總凱氮量并不存在，英語維基百科對(duì)應(yīng)頁面為Total Kjeldahl Nitrogen。�？倓P氮量有時(shí)并不能真正地反映樣本中的蛋白質(zhì)含量，因?yàn)樗鶞y定的部分含氮量可能不是由蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化來的。

（一）消化
1、準(zhǔn)備6個(gè)凱氏燒瓶，標(biāo)號(hào)。1、2、3號(hào)燒瓶中分別加入適當(dāng)濃度的蛋白溶液1.0mL，樣品要加到燒瓶底部，切勿沾在瓶口及瓶頸上。再依次加入硫酸鉀-硫酸銅接觸劑0.3g，濃硫酸2.0mL，30%過氧化氫1.0mL。4、5、6號(hào)燒瓶作為空白對(duì)照，用以測定試劑中可能含有的微量含氮物質(zhì)，對(duì)樣品測定進(jìn)行校正。4、5、6號(hào)燒瓶中加入蒸餾水1.0mL代替樣液，其余所加試劑與1、2、3號(hào)燒瓶相同。
2、將加好試劑的各燒瓶放置消化架上，接好抽氣裝置。先用微火加熱煮沸，此時(shí)燒瓶內(nèi)物質(zhì)炭化變黑，并產(chǎn)生大量泡沫，務(wù)必注意防止氣泡沖出管口。待泡沫消失停止產(chǎn)生后，加大火力，保持瓶內(nèi)液體微沸，至溶液澄清后，再繼續(xù)加熱使消化液微沸15min。在消化過程中要隨時(shí)轉(zhuǎn)動(dòng)燒瓶，以使內(nèi)壁粘著物質(zhì)均能流入底部，以保證樣品完全消化。消化時(shí)放出的氣體內(nèi)含SO2，具有強(qiáng)烈刺激性，因此自始自終應(yīng)打開抽水泵將氣體抽入自來水排出。整個(gè)消化過程均應(yīng)在通風(fēng)櫥中進(jìn)行。消化完全后，關(guān)閉火焰，使燒瓶冷卻至室溫。

（二）蒸餾和吸收
蒸餾和吸收是在微量凱氏定氮儀內(nèi)進(jìn)行的。凱氏定氮蒸餾裝置種類甚多，大體上都由蒸氣發(fā)生、氨的蒸餾和氨的吸收三部分組成。
1、儀器的洗滌
儀器安裝前，各部件需經(jīng)一般方法洗滌干凈，所用橡皮管、塞須浸在10%NaOH溶液中，煮約10min，水洗、水煮10min，再水洗數(shù)次，然后安裝并固定在一只鐵架臺(tái)上。
儀器使用前，微量全部管道都須經(jīng)水蒸氣洗滌，以除去管道內(nèi)可能殘留的氨，正在使用的儀器，每次測樣前，蒸氣洗滌5min即可。較長時(shí)間未使用的儀器，重復(fù)蒸氣洗滌，不得少于三次，并檢查儀器是否正常。仔細(xì)檢查各個(gè)連接處，保證不漏氣。

首先在蒸氣發(fā)生器中加約2/3體積蒸餾水，加入數(shù)滴硫酸使其保持酸性，以避免水中的氨被蒸出而影響結(jié)果，并放入少許沸石（或毛細(xì)管等），以防爆沸。沿小玻杯壁加入蒸餾水約20mL讓水經(jīng)插管流入反應(yīng)室，但玻杯內(nèi)的水不要放光，塞上棒狀玻塞，保持水封，防止漏氣。蒸氣發(fā)生后，立即關(guān)閉廢液排放管上的開關(guān)，使蒸氣只能進(jìn)入反應(yīng)室，導(dǎo)致反應(yīng)室內(nèi)的水迅速沸騰，蒸出蒸氣由反應(yīng)室上端口通過定氮球進(jìn)入冷凝管冷卻，在冷凝管下端放置一個(gè)錐形瓶接收冷凝水。從定氮球發(fā)燙開始計(jì)時(shí)，連續(xù)蒸煮5min，然后移開煤氣燈。沖洗完畢，夾緊蒸氣發(fā)生器與收集器之間的連接橡膠管，由于氣體冷卻壓力降低，反應(yīng)室內(nèi)廢液自動(dòng)抽到反應(yīng)室外殼中，打開廢液排出口夾子放出廢液。如此清洗2～3次，再在冷凝管下?lián)Q放一個(gè)盛有硼酸-指示劑混合液的錐形瓶使冷凝管下口完全浸沒在溶液中，蒸餾1～2min，觀察錐形瓶內(nèi)的溶液是否變色。如不變色，表示蒸餾裝置內(nèi)部已洗干凈。移去錐形瓶，再蒸餾1～2min，用蒸餾水沖洗冷凝器下口，關(guān)閉煤氣燈，儀器即可供測樣品使用。

2、無機(jī)氮標(biāo)準(zhǔn)樣品的蒸餾吸收

由于定氮操作繁瑣，為了熟悉蒸餾和滴定的操作技術(shù)，初學(xué)者宜先用無機(jī)氮標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行反復(fù)練習(xí)，再進(jìn)行有機(jī)氮未知樣品的測定。常用巳知濃度的標(biāo)準(zhǔn)硫酸銨測試三次。

取潔凈的100mL錐形瓶五只，依次加入2%硼酸溶液20mL，次甲基藍(lán)-甲基紅混合指示劑（呈紫紅色）3～4滴，蓋好瓶口待用。取其中一只錐形瓶承接在冷凝管下端，并使冷凝管的出口浸沒在溶液中。注意：在此操作之前必須先打開收集器活塞，以免錐形瓶內(nèi)液體倒吸。準(zhǔn)確吸取2mL硫酸銨標(biāo)準(zhǔn)液加到玻杯中，小心提起棒狀玻塞使硫酸銨溶液慢慢流入蒸餾瓶中，用少量蒸餾水沖洗小玻杯3次，一并放人蒸餾瓶中。然后用量筒向小玻杯中加入10 mL 30％NaOH溶液，使堿液慢慢流入蒸餾瓶中，在堿液尚未完全流入時(shí)，將棒狀玻塞蓋緊。向小玻杯中加約5mL蒸餾水，再慢慢打開玻塞，使一半水流入蒸餾瓶，一半留在小玻杯中作水封。關(guān)閉收集器活塞，加熱蒸氣發(fā)生器，進(jìn)行蒸餾。錐形瓶中的硼酸-指示劑混合液由于吸收了氨，由紫紅色變成綠色。自變色時(shí)起，再蒸餾3～5min，移動(dòng)錐形瓶使瓶內(nèi)液面離開冷凝管下口約lcm，并用少量蒸餾水沖洗冷凝管下口，再繼續(xù)蒸餾1min，移開錐形瓶，蓋好，準(zhǔn)備滴定。

在一次蒸餾完畢后，移去煤氣燈，夾緊蒸氣發(fā)生器與收集器間的橡膠管，排除反應(yīng)完畢的廢液，用水沖洗小玻杯幾次，并將廢液排除。如此反復(fù)沖洗干凈后，即可進(jìn)行下一個(gè)樣品的蒸餾。按以上方法用標(biāo)準(zhǔn)硫酸銨再做兩次。另取2mL蒸餾水代替標(biāo)準(zhǔn)硫酸銨進(jìn)行空白測定二次。將各次蒸餾的錐形瓶一起滴定。

3、未知樣品及空白的蒸餾吸收

將消化好的蛋白樣品三支，空白對(duì)照液三支，依次作蒸餾吸收。

加5mL熱的蒸餾水至消化好的樣品或空白對(duì)照液中，通過小玻杯加到反應(yīng)室中，再用熱蒸餾水洗滌小玻杯3次，每次用水量約3mL，洗滌液一并倒入反應(yīng)室內(nèi)。其余操作按標(biāo)準(zhǔn)硫酸銨的蒸餾進(jìn)行。

由于消化液內(nèi)硫酸鉀濃度高而呈粘稠狀，不易從凱氏燒瓶內(nèi)倒出，必須加入熱蒸餾水5 mL稀釋之，如果有結(jié)晶析出，必須微熱溶解，趁熱加入玻杯，使其流入反應(yīng)室。此外，還應(yīng)當(dāng)注意趁儀器洗滌尚未完全冷卻時(shí)立即加入樣品或空白對(duì)照液，否則消化液通過冷卻的管道容易析出結(jié)晶，造成堵塞。
（三）滴定
樣品和空白蒸餾完畢后，一起進(jìn)行滴定。
打開接受瓶蓋，用酸式微量滴定管以0.0100mol/L的標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液進(jìn)行滴定。待滴至瓶內(nèi)溶液呈暗灰色時(shí)，用蒸餾水將錐形瓶內(nèi)壁四周淋洗一次。若振搖后復(fù)現(xiàn)綠色，應(yīng)再小心滴入標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液半滴，振搖觀察瓶內(nèi)溶液顏色變化，暗灰色在一二分鐘內(nèi)不變，當(dāng)視為到達(dá)滴定終點(diǎn)。若呈粉紅色，表明已超越滴定終點(diǎn)，可在已滴定耗用的標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液用量中減去0.02mL，每組樣品的定氮終點(diǎn)顏色必須完全一致。空白對(duì)照液接受瓶內(nèi)的溶液顏色不變或略有變化尚未出現(xiàn)綠色，可以不滴定。記錄每次滴定耗用標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液毫升數(shù)，供計(jì)算用。

三、結(jié)果與計(jì)算

運(yùn)算下列公式計(jì)算出每次無機(jī)氮標(biāo)準(zhǔn)樣品和未知樣品的總含氮量。

式中
WN——每毫升樣品的含氮毫克數(shù)；

A——滴定樣品消耗的鹽酸量（mL）；

B——滴定空白消耗的鹽酸量（mL）；

C——測定樣品所取用量（mL）；

0.0100——標(biāo)準(zhǔn)鹽酸物質(zhì)的量濃度（mol/L）；

14.008——每摩爾氮原子質(zhì)量（g/mol）。

三次樣品測定的含氮量相對(duì)誤差應(yīng)小于±2%。

樣品粗蛋白含量＝總氮量× 6.25
6.25為含氮量換算為蛋白質(zhì)含量的系數(shù)。.這個(gè)系數(shù)來自蛋白質(zhì)平均含氮量為16％，實(shí)際上各種蛋白質(zhì)因氨基酸組成不同，含氮量不完全相同。

四、應(yīng)用

凱氏定氮法的普遍適用性、精確性和可重復(fù)性已經(jīng)得到了國際的廣泛認(rèn)可。它已經(jīng)被確定為檢測食品中蛋白質(zhì)含量的標(biāo)準(zhǔn)方法。